Можно ли измерить силу адгезии между клетками?

Адгезия — технический термин, буквально означающий «силу сцепления поверхностей разнородных тел». В биологию этот термин привнесен в связи с исследованием феномена межклеточных контактных взаимодействий в тканях, поскольку клетки могут взаимодействовать с поверхностям других соседних клеток, а также с естественными субстратами, к последним относится внеклеточный матрикс.

Эпителиальные клетки являют собой парадигму разнообразия молекулярных механизмов клеточной адгезии, которые опосредуют контактные взаимодействия между клетками, а также их позиционное положение в ткани. Поверхность эпителиальной клетки неоднородна как по составу, так и по силе и характеру адгезивных и контактных взаимодействий, которые реализуются между отдельными участками поверхностей соседних клеток. В связи с этим, задача определения силы адгезии некоторой конкретной клетки в ткани является практически невыполнимой, даже если клеточную адгезию воспринимать как суммарную силу взаимодействий, в которые вступает данная клетка. Тем не менее, попытку оценить величину адгезионных взаимодействий между клетками предпринималась неоднократно различными исследователями. Такой интерес к данной задаче объясняется не только любознательностью исследователей, но и тем, что конкретная величина адгезии между клетками указывала бы на возможный механизм данного взаимодействия. Дело в том, что ряд исследователей считали, что клетки взаимодействуют за счет фрагментов белков, полисахаридов, которые располагаются в межклеточном пространстве и хаотически взаимодействуют за счет электростатических сил. Однако, многие утверждали, что между клетками находятся определенные белки, которые выполняют роль «межклеточного клея или цемента», т.е. которые действительно обусловливают взаимодействие между клетками в ткани и определяют ее структуру.

К решению этой задачи наиболее приблизился Соman, который в 1944 г разработал метод оценки силы сцепления между клетками с помощью специального, созданного им манипулятора. Метод был применен для определения силы адгезии между клетками эпителия мочевого пузыря жабы. Значительные размеры и монослойное культивирование этих клеток позволили произвести оценку силы их сцепления под микроскопическим контролем. Позже Coman модифицировал свой метод для исследования трехмерных фрагментов ткани и применил его при изучении биопсийного материала онкологических больных. В этом случае было проведено измерение усилия, необходимого для отрыва группы клеток от основной массы тканевого фрагмента. В результате этого исследования было установлено, что малигнизированные (злокачественные) клетки характеризуются значительно меньшей силой сцепленности, по сравнению с нормально функционирующими клетками. Был сделан вывод о том, что при злокачественном росте происходит нарушение контактных межклеточных взаимодействий. Картина нарушения межклеточных контактов в опухоли поразительно сходна с таковой, полученной в эксперименте при перфузии печени растворами, содержащими Са+2-хелатирующие агенты.

Однако многие исследователи пытались другими способами оценить силу взаимодействия между клетками. Длительное время для оценки состояния клеточной адгезии использовали экспериментальную модель агрегации клеток в суспензионных культурах in vitro, которую разработал Moscona. Он же применил эту модель для поиска и исследования белков, участвующих в адгезионном процесс. Фактически он разработал метод агрегации, основанный на способности изолированных клеток образовывать при культивировании многоклеточные агрегаты. Адгезивную активность исследуемых белков в этой модели оценивали, подсчитывая количество одиночных клеток в суспензии или определяя размер образовавшихся клеточных агрегатов. Метод был с успехом применен при изучении адгезивных белков, выделенных из морских губок, а также сетчатки куриных эмбрионов. С помощью метода клеточной агрегации удалось не только обнаружить адгезивные белки, но и изучить влияние других физико-химических факторов на агрегацию клеток in vitro.

Метод агрегации обладает рядом принципиальных недостатков. Наиболее значительным из них является тотальное повреждение поверхности клеток в процессе приготовления суспензионных культур (обработка тканей ферментами, хелатирующими ионы металлов соединениями, механическая дезинтеграция и т.д.). Следует отметить, что у эмбриональных клеток, дифференцировка которых была незакончена и далека от дефинитивного состояния, существует возможность для восстановления поврежденной поверхности, но для клеток взрослых особей, находящихся в дефинитивном состоянии, такая возможность практически отсутствует.

Другие адгезиометрические методы, разработанные для оценки состояния межклеточной адгезии в тканях основывались также на определении величины параметров, характеризующих механическую сцепленность клеток в момент отрыва их друг от друга, который осуществлялся, например, с помощью фиксированных микроигл или потоков жидкости, или же при механическом диспергировании ткани [Маленков, Модянова, 1968; Модянова, 1968; Маленков, Чуич, 1979].

Основным современным методом исследования адгезионных взаимодействий клеток является иммунохимический, в основе которого лежит изучение участвующих в клеточной адгезии поверхностных антигенов [Damsky et al., 1983; Gallin et al., 1983; Ogou et al., 1983; Thiery et al., 1984; Hatta et al., 1985], а также метод электронной микроскопии, с помощью которого можно оценить состояние плазматической мембраны клетки и специализированных ультраструктур межклеточных контактов [Goodenough, Gilula, 1974; Overton, 1974; Gilula, 1978; 1985; Ушаков, Черненко, 1978; Ушаков, 198О; 1982]. С помощью такого методического подхода были идентифицированы практически все известные ныне белки межклеточного пространства [Anderson, 1990; Turner, 1992; Riechardt, 1993].

Успех исследований, выполненных с помощью такой методической стратегии, в основном, определяет способность изучаемых белков эффективно проявлять антигенные свойства. В ином случае, т.е. когда белки являются слабыми антигенами, их идентификация с помощью указанного методического подхода оказывается трудно выполнимой. Необходимо отметить, что к настоящему моменту в литературе отсутствуют экспериментальные данные, которые бы отрицали присутствие среди белковых компонентов межклеточного пространства — слабых антигенов, а в таком случае они могли быть не идентифицированны с помощью иммунохимических методов исследования.

Таким образом, современный методический подход, применяемый для исследования молекул адгезии, позволил выявить белки, которые характеризуются высокими значениями молекулярной массы, структурной сложностью и проявляют выраженные антигенные свойства [Anderson, 1990; Turner, 1992]. В связи с этим, разработка экспериментального подхода, основанного на способности компонентов межклеточного пространства проявлять совершенно иные свойства (физико-химические или биологические) представлялась весьма актуальной.

Адгезивные белки выделяют обычно путем экстракции гомогената ткани растворами детергентов [Anderson, 1990; Riechardt, 1993]. Иногда используют для солюбилизации исследуемой белковой фракции препарат плазматических мембран, в таком случае удается выделить трансмембранные, интегральные белки, участвующие в клеточной адгезии. В отдельных случаях на начальном этапе экстракции адгезивных белков ткань обрабатывают ферментами или растворами хелатов [Reichardt, 1993].

Основой для разработки методов выделения адгезионноактивных белков печени млекопитающих явились данные исследования свойств жидкости, оттекаемой при перфузии печени мышей Са+2-несодержащим физиологическим раствором [Modjanova, Malenkov, 1973]. Получаемый таким образом перфузат способствовал усилению адгезионных клеточных взаимодействий (сцепленность клеток) и оказывал влияние на пролиферативную активность гепатоцитов мышей позднего плодного периода [Маленков, Модянова, 1970; Модянова, Маленков, 1975; Modjanova, Malenkov, 1973]. Эта работа наших ученых – А.Г. Маленкова и Е.А. Модяновой, была первой и исключительно важной для развития всего этого направления исследований, которое привело к обнаружению новой надмолекулярной структуры межклеточного пространства – «малого матрикса», который состоял из белково-пептидных комплексов и обладал оригинальными физико-химическим свойствами и уникальным биологически действием. Именно, белково-пептидные комплексы «малого матрикса», выделенные позже из других различных тканей позвоночных животных и явились основой для разработки Виоргонов и Виофтанов -такое коммерческое название получили эти адгезивные надмолекулярные структуры межклеточного пространства. Прошло около 50 лет непрерывной работы, в которой участвовали более ста сотрудников разных НИИ, прежде, чем мы смогли представить Виоргоны и Виофтаны как разработку новых биологически активных веществ, способных влиять на функцию не только клеток, но и тканей, органов и цело